Anti-Fc-MMAE二抗

1.产品概述

在抗体偶联药物(ADC)研发过程中,候选抗体与靶蛋白结合后的内吞效率,是评价ADC候选抗体的一个关键属性。研究人员通常将候选抗体在4度与37度分别与靶细胞进行孵育,通过FACS评估抗体的内吞效率,即温差法,此方法常出现假阳性的内吞结果;通过pH敏感的溶酶体染料与候选抗体偶联后进行检测的方法,受限于每个候选抗体进行偶联及纯化的繁复实验操作流程,且成本较高。本产品在针对IgG Fc(CH2-CH3)的兔单克隆抗体上偶联了VC-PAB-MMAE分子,作为一款通用二抗偶联物(平均DAR=4),能够与Human IgG1 Fc、Mouse IgG1\IgG2a\IgG2b Fc结合,可以高通量对候选ADC抗体的内吞进行定性及定量检测。

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 图 1. Anti-IgG Fc-MMAE检测原理示意图

2. 产品特点

− 代替传统的荧光方案,评价候选抗体介导的靶细胞杀伤,对候选抗体进行排序;

− 结合我们开发的细胞活力检测试剂盒(Cell Viability-Lumi Kit:ICA-CVL-100A)可高通量评价候选候选抗体的内吞效率;

− 检测结果与抗体的内吞效率具有直接相关性,避免假阳性或假阴性结果;


3.产品规格

名称

货号

规格

Anti-Fc-MMAE

IDC001

100ug


4.储存条件

-80℃冰箱储存,避免反复冻融。【建议首次开启后,根据需要进行分装】


5. 参考实验流程

1) 材料:

− Anti-Fc-MMAE【首次开启后,分装保存于-80度冰箱中,避免反复冻融】

− Cell Viability-Lumi Kit【首次开启后,分装保存于-80度冰箱中,避免反复冻融】

− 待测靶细胞

− 白边底不透明的96孔或384孔细胞培养板


2) 实验步骤:

(1) 细胞复苏

根据实验需要,从液氮中复苏靶细胞,并连续传代3次,调整至对数生长期。

(2) 细胞处理

取对数增殖期的靶细胞,用完全培养基重悬为细胞浓度为5×10^4个/mL 。向96孔板四周的孔中加入无菌水100μL/孔,避免连续培养过程中实验孔内液体过度蒸发;向其余孔内先后加入100μL/孔细胞悬液,置于5% CO2、37℃培养箱中培养24h待细胞贴壁(若靶细胞为悬浮细胞,接种后可立即进行药物处理)。

用完全培养基配置2x Rabbit Anti-Fc-MMAE稀释液(浓度2μg/mL),此为本次实验的Assay buffer。用Assay buffer与阳性对照抗体或候选抗体等比例混合,配制第一个浓度梯度点(候选抗体浓度10ug/mL),后续用Assay buffer按照3倍梯度稀释,共9个浓度梯度,每个稀释度设置3复孔。

将上述准备的细胞培养板中的培养基去除,加入上述配置的药物浓度梯度后,将培养板置于培养箱中培养4-5天。另取3个复孔加入100μL 1μg/mL的Rabbit Anti-IgG Fc-MMAE抗体稀释液做对照孔。当无药对照孔细胞汇合度大于80%时进行细胞活率检测。

(3) 检测

从-80度冰箱中取出Cell Viability-Lumi Kit,室温解冻,上下颠倒混匀后,根据待测的孔数,按照100uL/孔,加入到细胞板中,室温避光静置10min。

(4) 读数

将静置10min后的白边底不透明细胞培养板放入Luminometer中进行读数,并进行数据处理。


6.  注意事项

− 二抗本身对靶细胞的非特异性杀伤

在抗体浓度较大的情况,二抗自身可能对靶细胞的增殖产生抑制作用。建议针对不同的靶细胞探索不同浓度的二抗对其增殖活力的影响(一般在3ug/mL以下进行探索)。

− 无菌

药物处理时间较长,需要全程无菌操作,对候选抗体进行无菌过滤。


7. 展示数据

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