GPCR（G-protein coupled receptor，G-蛋白偶联受体）是一类在人和动物中，广泛存在于细胞膜上的最大膜蛋白家族。细胞膜上的GPCR与细胞外的内源配体结合后被激活，通过（一）与细胞内G-蛋白结合，激活G-蛋白，诱导生成第二信使（cAMP，IP3/DAG）及G-蛋白亚基，激活下游信号传导通路；（二）同时或随后结合beta-arrestin，诱导beta-arrestin介导的下游信号通路，实现传导细胞外生理信号到细胞内，对细胞、组织及器官进行代谢、生理功能的调节。

所有GPCR蛋白均是由一条氨基酸单链所构成。如图1所示，GPCR氨基酸链从细胞外的N-端（N-terminus）开始，穿过细胞膜双脂层，再回穿过细胞膜，如此往返7次，形成7个跨膜域（7 transmembrane domains，7TM),3个膜外环链（extracellular loop，EL）和3个膜内环链（intracellular loop, IL），C-端（C- terminus）在细胞内。7TM在细胞膜中形成桶状结构，其氨基酸序列在同一类型GPCR中相似度高，GPCR其它区域氨基酸序列则具备不同程度的特异性。GPCR蛋白在被合成转运至细胞膜上的过程中，被进行多种翻译后修饰（post-translationalmodification），如糖基化（glycosylation）；与激动剂结合被激活，构象（conformation structure）会发生相应改变，并被被进一步修饰，如磷酸化（phosphorylation）。GPCR氨基酸序列和被修饰的特异性，决定每一GPCR的可能构象结构、与配体、G-蛋白、beta-arrestin结合和信号传导的特异性。

图1. GPCR在细胞膜上的结构、主要氨基酸模序、修饰及蛋白结合位点示意图

GPCR按氨基酸序列相似性可以分为7个家族，人GPCR蛋白目前按系统发生分析方法（phylogenetic analyses）可以分为5类（GRAFS)。图2显示了5个GPCR家族（A, B, C, D, E)在细胞膜上的结构示意图。A、B、C家族分别对应人GPCR的R（Rhodopsin-likefamily），SA(Secretin &Adhesion family）和 GT (Metabotropic Glutamate, Taste 1 family）类。D为真菌交配弗洛蒙受体家族(Fungal mating pheromone receptors)，E为盘基网柄菌cAMP受体（Dictyostelium discoideum, cAMP receptors）。不同家族的GPCR蛋白有以下几处显著差异：（1）N-端氨基酸链的长度和序列；（2）配体与GPCR结合的位点（注：a.结合位点与各类受体可结合的配体类别和大小相关；b. A家族受体数量最大，图2显示的膜内结合位点仅代表部分与小分子配体结合的GPCR，不反映A家族的多肽和蛋白类GPCR的配体结合位点）；（3）C-端氨基酸链的长度。图2中显示同一家族GPCR在跨膜和近膜结构中具有不同数量的保守氨基酸，及N-端和近膜端保守的可被棕榈化和形成二硫键的半胱氨酸（cysteine）。这些氨基酸在维持GPCR在细胞膜上的结构、构象及与配体特异结合上，发挥着重要作用。

图2. GPCR家族分类、结构及其氨基酸序列、配体结合位点的异同处

人体内共有约800种GPCR表达，其中~400种为嗅觉受体（olfactory receptors），其余398种GPCR为非嗅觉受体。A家族GPCR种类最多，有约670种GPCR，占所有GPCR总数的80%。B家族GPCR其次，有约50种GPCR。当前，所有已上市或在研的GPCR药物靶点均属非嗅觉GPCR。据2017年7月统计报道，目前世界上共有475个药物以GPCR为靶点，占所有FDA批准药物的34%左右，其中314个药物作用于A家族GPCR中的氨类受体（aminergic receptor），以小分子为主。在398种非嗅觉GPCR中，已批准的靶向GPCR的药物仅作用于其中的108种GPCR；66种无上市药物的GPCR处于临床研究阶段，其中37种GPCR的内源配体为多肽或蛋白；多达224种GPCR还没有成为任何进入临床试验的药物靶点。

GPCR内源性配体具极大多样性，包括离子，信号小分子，脂类，多肽和蛋白。靶向GPCR的药物通常依据特定GPCR的内源性配体进行理化性质设计和开发，与内源性配体具一定相类性。目前上市的靶向GPCR药物绝大多数为小分子。多肽类靶向GPCR药物数量较少，但如GLP-1（glucagon-likepeptide-1）类似物（exenatide, liraglutide, lixisenatide, albiglutide，dualglutide，semaglutide），作为GLP-1R激动剂，在治疗2型糖尿病中，展示了显著效果，占有大量市场份额。

那么，靶向GPCR的蛋白类药物开发状况到底如何呢？

当前只有2个GPCR单克隆抗体（mAb）药物获批上市 (CCR4 mAb, mogamulizumab，治疗淋巴瘤lymphoma；CGRPRmAb，Erenumab，治疗偏头痛migraine）。有近40个靶向少数几种GPCR的mAb处于临床前或临床药物研发阶段。靶向GPCR膜外区域的纳米抗体药物研究（下节介绍）则仅处于早期的临床前和实验室研究阶段。按配体性质分析GPCR家族，可以发现，在非嗅觉GPCR中，有130种GPCR是多肽和蛋白类受体。这些GPCR均可作为潜在、成药性高的蛋白特别是抗体药物靶点。理论上，其它任何GPCR均可能成为蛋白类药物靶点。因而，开发靶向GPCR的蛋白类药物空间巨大。

3.1 纳米抗体（nanobody，Nb）

如图3所示，常规抗体（antibody， Ab）由2条重链（含CH1-3和VH区）和2条轻链（含CL和VL区）组成。而骆驼科动物（如羊驼）由于一系列生殖细胞基因突变和删除，血液中表达一种独特的天然缺失轻链的单链抗体，该抗体只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区，被称为重链唯一抗体（HcAbs，heavy chain only-antibodies）。其在免疫系统中仍然能够进行亲和力和选择性成熟改变，从而在两个相等的单个可变区内聚集所有的抗原结合能力。依据骆驼科动物重链可变区（VHH）的结构可以通过生物工程技术衍化生成特异单域抗体（sdAb， single domain Abs)。因VHH抗体结晶为直径2.5nm,长4nm,分子量只有15KDa, 因此对应的sdAb，或VHH抗体被称为为纳米抗体（Nanobody©,Nb）（图3）。软骨科鱼（如鲨鱼）也被发现表达HcAbs，其重链可变区（VH）及对应的sdAb被称为VNAR（variable new antigen receptor）。

图3. 常规抗体（IgG）和骆驼科动物体内重链单一抗体（HcAb）的组成结构及其衍生的特异抗体。

3.2 纳米抗体的优势

相对于传统抗体，纳米抗体体积小，分子量（~15 KDa）只有传统抗体的十分之一，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。可穿透血脑屏障，对人的免疫原性弱。相比体积也小的抗体衍生片段（分子量为传统抗体的1/3-1/6），如Fab片段，单链抗体片段（scFv，single-chain variable fragments），纳米抗体没有这些片段容易相互沾粘，甚至聚集成块的缺点。更重要的是纳米抗体保持了与原重链抗体相当的高结构稳定性、溶解性以及与抗原的结合活性。纳米抗体的另外一个重要优势是可以在细菌和酵母中高产量生产。

比较纳米抗体和Fab结合位点，及与GPCR的结合部位，如图4所示，纳米抗体具有较传统抗体长的CDR3 （complementarity determining region，互补决定区），可以形成更为凸起的抗体结合部位（paratope），因而能够结合隐藏的GPCR免疫表位（epitope）。这些特性使得设计出结合GPCR精细、隐蔽位点的特异纳米抗体成为可能。

图4. 抗体结合部位（paratope）及Fab片段和纳米抗体（nanobody）与GPCR的结合。

A) Fab片段有一较大的凹型抗体结合部位，相对应，纳米抗体抗体结合部位小而凸。B) Fab片段VH/VL区和VHH区/纳米抗体结构示意图。C) Fab片段的结合位点形状适宜结合线性免疫表位（如GPCR的N-端, N-terminus)，而纳米抗体能够结合结合隐藏的免疫表面，如GPCR的配体结合口袋（binding pockets）。

3.3 纳米抗体作为GPCR构象稳定器

GPCR在细胞膜上始终处于一个动态过程，可以多种构象存在。GPCR激动剂（agonist），拮抗剂（antagonist）或反向激动剂（inverse agonist）与GPCR结合并诱导不同的构象变化。获得并分析GPCR的晶体结构对于研究GPCR与配体结合时的结合位点和构象、功能和调节及药物设计非常重要。目前，多数GPCR晶体结构是在小分子拮抗剂结合状态下获得的非激活构象。对于小分子激动剂结合状态下的GPCR激活构象，因其呈现为非均质相，则难以获得具高分辨率的晶体结构。利用纳米抗体的体积微小、具高特异、高亲和力的特点，科学家使用纳米抗体克隆Nb80结合β2AR膜内结合区，稳定β2AR与激动剂BI-167107结合，成功解析出激活状态下的β2AR晶体结构。

纳米抗体还作为G-蛋白类似物，被用来稳定GPCR（M2R, μ-OR, κ-OR，US28）的活性构象，获得晶体并被解析结构。研究人员还将纳米抗体与GPCR (β2AR, M2R or μ-OR) C-端链接，锁定受体活性构象，进行基于片段的筛选（fragment-based screen），筛选出偏好结合受体活性结构的片段。

3.4 纳米抗体调节GPCR功能

纳米抗体按其与GPCR在细胞上的结合部位划分为两类：细胞膜外纳米抗体（extracellular nanobody）和细胞膜内纳米抗体（intracellular nanobody，intrabody）。

（1）细胞膜外纳米抗体（extracellular nanobody）

纳米抗体因其结构简单，可以开发成多种形式，如单价Nb（monovalent，1 Nb结合1个免疫表位），双价Nb（bivalent，2 个链接的Nb结合到同一免疫表位），双特异性Nb（bispecific，2个链接的Nb链接结合到不同靶点), 双抗体结合位点Nb（biparatopic，2个链接的Nb结合同一靶点上的2个免疫位点），及3价Nb（trivalent，链接3个Nb）等。不同结构的纳米抗体能够增加Nb亲和力和效能，获得不同的药理学作用。表1列出了靶向CXCR2，CXCR4，ACKR3 (CXCR7)， US28和mGluR的不同形态的膜外纳米抗体克隆及相应的药理学活性。这些膜外纳米抗体与GPCR结合，能够展示出拮抗剂（antagonist）作用，反向激动剂（inverse agonist）作用，反向或正向别构调节剂（NAM, negative allosteric modulatotor；PAM，positive allosteric modulator）作用。需要提出的是，目前难以获得具有激动作用的单克隆抗体，纳米抗体也是一样。当然，通过基因工程技术，直接链接自然肽类激动剂或其类似物到抗体，有可能获得作为激动剂的靶向GPCR抗体。

表1.细胞外或细胞内靶向GPCR的纳米抗体、应用和药理活性概况

（2）细胞膜内纳米抗体（intracellular nanobody，intrabody）