Hello大家好，还记得上次小爱在《CAR-T细胞如火如荼，CAR-巨噬细胞表示不服》中说到的文献“Chimeric antigen receptors that trigger phagocytosis”不，今天就由实验喵本喵带着大家一起来看一下这篇文献吧~~

总括

嵌合抗原受体（CARs）是合成受体，可以重新编程T细胞使得T细胞能够杀死肿瘤细胞。CAR-T细胞免疫疗法的成功使得基因工程免疫细胞的前景更为明朗，也意味着CAR-T策略可以应用于其他免疫细胞。作者研究设计了一个吞噬作用嵌合抗原受体家族（CAR-Ps），它可以指导巨噬细胞吞噬特定目标，包括癌细胞。CAR-Ps由细胞外抗体片段组成，胞外段被修饰后，可以指导CAR-P靶向特定抗原。通过筛选一组吞噬受体胞内结构域，发现Megf10和FcRγ的胞内域更好的引发了巨噬细胞的吞噬作用。

研究显示CAR-P促进了巨噬细胞对抗原包被合成颗粒和人类癌细胞的特异性吞噬，募集的PI3K可以增加这一吞噬作用。研究显示，将癌细胞和表达CAR-P的小鼠巨噬细胞共培养后，癌细胞减少了40%以上。

接下来我们来看看具体是怎么回事。

作者研究了新的嵌合受体用以靶向吞噬，将其命名为CAR-P（嵌合抗原受体）。CAR-P包含可识别B细胞抗原CD19（αCD19）的胞外单链抗体可变区片段scFv和CD8跨膜结构区域。作者筛选了几个已知的小鼠吞噬细胞受体库：Megf10（图1a），FcRγ、Bai1和MerTK，以CAR-P^GFP（含有胞外αCD19抗体片段及胞质GFP，不含有信号域）为对照。其中FcR引发了吞噬，其他受体则是识别凋亡细胞等碎片。作者用慢病毒将CAR-P转入J774A.1小鼠巨噬细胞，用带有脂双层的二氧化硅beads作为吞噬目标，beads直径5μm。带有His₈标记的CD19胞外结构和嵌入脂双层的NiNTA-lipid结合。与不具有CAR的巨噬细胞相比，表达CAR-P^Megf10或CAR-P^FcRγ的巨噬细胞对CD19 beads的吞噬更为显著（图1b c，图1—视频1）。

图1

而表达CAR-P^Bai1、CAR-P^MerTK和仅表达CAR-P^GFP的巨噬细胞则不会吞噬CD19 beads（图1b、c、图1 —补充图1）。

图1—补充图1

为了证实CAR-P编程初级巨噬细胞是可行的，研究者在原代BMDM（小鼠骨髓巨噬细胞）中表达了CAR-P^FcRγ，发现这些巨噬细胞也能够吞噬CD19 beads。为了验证CAR-P可以靶向其他抗原，作者把αCD19 CAR-P^Megf10换成了αCD22 CAR-P^Megf10。与前面的实验结果一致，αCD22 CAR-P^Megf10可以促进巨噬细胞对CD22 beads的吞噬（图2a）。

之后，作者将αCD19 CAR-P^Megf10巨噬细胞和CD22 beads共培养，αCD22 CAR-P^Megf10巨噬细胞和CD19 beads共培养。结果αCD19 CAR-P^Megf10巨噬细胞并没有吞噬CD22 beads，αCD22 CAR-P^Megf10巨噬细胞也没有吞噬CD19 beads（图2a）。这一结果表明CAR-P^Megf10能够引发巨噬细胞吞噬特异目标且能够靶向多种癌症抗原。

为了进一步验证CAR-P的促进能力，研究者对CAR-P巨噬细胞可吞噬beads的大小进行了研究，研究发现，CAR-P^Megf10能够促使巨噬细胞吞噬2.5-20μm大小的beads（图2b）。 作者进一步测试了改造后巨噬细胞对带有磷脂酰丝氨酸（内源性Megf10配体）的10μm beads的吞噬作用，发现CAR-P^Megf10巨噬细胞对CD19 beads和对含有10%磷脂酰丝氨酸及ICAM（粘附分子）beads的吞噬效率相似。

图2

为了确定CAR-P^Megf10是否是在细胞间连接处启动信号传递，作者将磷酸酪氨酸进行染色。结果显示，在细胞连接处CAR-P^Megf10巨噬细胞的磷酸酪氨酸增加（图3a）。而表达CAR-P^GFP的巨噬细胞则没有这种增加。与此相一致的是，细胞bead连接处的F-肌动蛋白也有富集的现象（图3—补充图1）。这一结果表明，CAR-P^Megf10通过与受体型酪氨酸磷酸酶相关的局部信号级联反应引发吞噬。 

图3—补充图1

成功引发巨噬细胞吞噬的胞内结构域（FcRγ和Megf10）都具有ITAMs（胞质免疫受体酪氨酸基激活Motifs），这些Motifs被Src家族激酶磷酸化。基于这一现象，我们假设当含有ITAM的受体在巨噬细胞中表达时能够引起吞噬作用。T细胞受体的CD3ζ亚单位包含有三个ITAM基序，为了验证CD3ζ链能否激活吞噬信号，作者用第一代CAR转导巨噬细胞（图3b）。CAR能够像CAR-P^Megf10一样引发巨噬细胞吞噬CD19 beads（图3c）。T细胞内，磷酸化的CD3ζITAMs与激酶ZAP70中的串联SH2结构域（tSH2）结合。ZAP70在巨噬细胞中不表达，但是Syk（一种吞噬信号效应物，tSH2结构域含有蛋白质）却高水平表达。

先前研究表明，Syk激酶也可以结合CD3ζ的ITAMs，这说明CAR-T可能通过与CAR-P^FcRγ相似的机制促进吞噬作用。为了定量比较Syk-SH2和CD3ζ或FcRγ在膜近端系统中的相互作用，作者进行了脂质体相关分析（图3d）。

先前在这个系统中，His₁₀-CD3ζ和His₁₀-Lck（CD3ζ磷酸化激酶）通过NiNTA-lipids结合到脂质体上。作者使用荧光淬灭法来测量SH2串联结构域（已标记）和磷酸化CD3ζ的结合。结果显示，Syk-tSH2以相似的亲和力结合CD3ζ和FcRV (分别约为15 nM和30 nM，图3d )。总的来说，这些结果表明CAR-P中的TCR CD3ζ链可以促进吞噬作用，这可能是通过Syk激酶来实现的。