GPCR (G Protein-Coupled Receptor)，即G蛋白偶联受体，是哺乳动物基因组中最大的膜蛋白家族，广泛分布于中枢神经系统、免疫系统、心血管等器官和组织，参与机体的发育和正常功能行使。与其相关的细胞内通路调节一旦发生异常，或者外源病原物以之为受体攻击机体细胞，则会导致一系列疾病的发生。因此，GPCR被视为重要的药物开发靶点，围绕GPCR家族成员的抗体药物研发意义重大。
血管紧张素系统中的血管紧张素受体AT1R、AT2R是GPCR超家族的成员之一，已有研究表明，AT1R受体的激活引起血管收缩，细胞增殖迁移、炎症纤维化、心肌再塑和肥厚等疾病。当前，围绕该受体的靶向治疗药主要以小分子药为主，如厄贝沙坦、缬沙坦、替米沙坦等ARB类药物，已成为高血压和肾脏疾病的一线治疗方法。尽管ARB在多数患者中是安全有效的，但由于小分子极易穿过胎盘，并表现出严重的胚胎毒性，因而无法在怀孕期间使用，也就限制了妊娠期高血压疾病，包括先兆子痫等的药物治疗。而如果可以找到替代ARB类药的大分子生物药，如靶向AT1R蛋白的单抗药物，或可为妊娠期高血压疾病提供更加安全的方法。近日，来自哈弗医学院、杜克大学等机构的Laura Wingler等研究人员在PNAS杂志发表了一项研究，公布了他们发现的一种靶向AT1R的合成纳米抗体AT118，动物实验表明，AT118显示了与ARB类降压药氯沙坦相当的降压活性，这一发现为治疗高血压疾病提供了新的研究途径。DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2009029117纳米抗体AT118的发现
为了发现靶向人AT1R的纳米抗体，Wingler团队利用酿酒酵母构建了一个5*108的合成纳米抗体文库，随后通过FACS分选阳性克隆，获得了可与AT1R结合的48个单克隆，进一步的分离和测序分析发现，纳米抗体AT117、AT118、AT120与ARB奥美沙坦具有中低纳摩尔的亲和性，从而证实它们与传统AT1R拮抗剂结合在同一位点。
奥美沙坦和纳米抗体AT118或AT120与AT1R的放射性配体竞争结合（图片来源：PNAS）
需要指出的是，两种纳米抗体AT118和AT120均显示出与放射性配体有较低的竞争性结合能力。对此，Wingler等人认为可以通过亲和力成熟来增加纳米抗体对AT1R的亲和力。使用error-prone
PCR诱变AT118，研究人员生成了一个新的酵母展示文库，该文库由8.4×107个突变的AT118克隆组成。经过两次连续FACS选择后，获得名为AT118i4的克隆。
细胞实验显示，与亲本克隆AT118相比，经过突变后的纳米抗体克隆的结合亲和力增强了近70倍。值得注意的是，AT118i4与AT1R在细胞膜上的亲和力可与常用ARB氯沙坦相当。AT118i4（蓝色）与奥美沙坦竞争结合HEK细胞膜中的AT1R，证明其亲和力高于AT118（红色）（图片来源：PNAS）
AT118i4的功能性验证
靶向GPCR的基于抗体的治疗剂，其潜在好处之一是可以实现非常高的受体亚型特异性，这可以减少临床应用中的副作用。确实，当研究者对表达AT1R或AT2R的细胞进行染色时，发现AT118i4与表达AT2R的细胞几乎没有结合，但显示了与表达AT1R的细胞的强结合。（[EC50] = 31 nM）。为了确定AT118i4是否有效拮抗AT1R信号，研究者用AngII（血管紧张素Ⅱ）处理了在AT118i4存在下AT1R阳性的HEK悬浮细胞，与对照（EC50=3.5nM）相比，经AT118i4（EC50=89nM）处理的细胞，其内源性心肌细胞Gq蛋白信号显著降低，表明AT118i4起到了反向激动剂的作用。另一方面，由Gq和β-抑制素信号激活的ERK磷酸化在用AT118i4处理的细胞中显著减少。
AT118i4的体内活性验证
鉴于AT118i4对细胞中血管紧张素信号的有效抑制作用与临床使用的ARB相当，Wingler及其研究团队推断，AT118i4可作为体内抗高血压药。为了检验AT118i4在小鼠模型中发挥功能，该团队用人AT1R或鼠AT1Ra对奥美沙坦和AT118进行了放射性配体竞争结合试验。与人AT1R相比，鼠AT1aR对AT118i4的亲和力显著降低，但对奥美沙坦的亲和力没有降低。由于鼠AT1Ra和人AT1R具有高度的保守性，在细胞外区域只有9个位置存在差异，Wingler等将这些差异作为突变引入到人AT1R中，以确定它们是否影响AT118的结合，结果发现细胞外突变（I164V/F170Y和q187r）显著降低了对AT118i4的亲和力，而其他突变均耐受。
流式细胞显示AT11814与表达AT1R的细胞的结合（图片来源：PNAS）
进一步的小鼠体内实验表明，AT118i4显著减轻了AngII效应引起的小鼠血压升高。相反，与AT1R胞内结合的对照纳米抗体则未阻断AngII效应。值得注意的是，AT118i4在阻断AngII感染雌性小鼠的效应方面比在雄性小鼠中更有效。将抗体片段用于治疗的另一个关键步骤是人源化以降低免疫反应性。为了获得更接近于人类抗体的重链，Wingler等人对AT118i4纳米抗体进行了人源化设计，与AT118i4相比，人源化纳米抗体AT118i4h32进一步增强了蛋白的表达、溶解性和稳定性。这些数据表明，从酵母展示文库中获得的AT118i4及其他纳米抗体易于被优化用于治疗应用。
AT118i4与人源化AT118i4h32的序列比较（图片来源：PNAS）
总结
总结来说，这项研究发现一种靶向AT1R的纳米抗体具有治疗妊娠期高血压和肾脏疾病的潜力，由于ARB和ACE抑制剂均具有严重的胎儿毒性，使得现有治疗方法在很大程度上不可能对孕妇肾素-血管紧张素-醛固酮系统进行药理学调节。不同于传统的小分子药物，一种蛋白质如果没有与FcRn受体结合的能力，就不能通过胎盘屏障。Wingler等人发现的这类基于纳米抗体的治疗方法或可为未来生产靶向GPCR的抗体药提供基础。1. Synthetic nanobodies as angiotensin receptor blockers.
