随着抗体筛选技术的不断发展，我们在疾病相关的抗体药物靶点的筛选上取得了相当大的成功。自1980年代中期以来，已经批准了100多种单克隆抗体用于治疗各种疾病，例如癌症，代谢紊乱和自身免疫性疾病，并用于预防移植后的排斥反应。同样，许多其他的抗体衍生药物也正在火热的开发中。但是，要维持这种可持续的发展，我们需要将抗体筛选的范围不断的扩大。因此，抗体筛选正在关注诸如离子通道和G蛋白偶联受体等相对复杂的目标。为了确保针对如此复杂的分子的发现工作不会出现问题或者偏差，研究人员推动了更好的筛选技术和更灵敏的检测方法。例如，研究人员正在从荧光激活细胞分选（FACS）中获得更多价值。

创新的流式细胞仪可用于鉴定可结合离子通道和G蛋白偶联受体之类的困难靶点的治疗性抗体。在此图中，显示出抗体（红色）与G蛋白偶联受体（蓝色）的结合，这与许多疾病有关。不幸的是，能够结合G蛋白偶联受体的抗体很难分离。为帮助简化候选抗体的鉴定和开发，研究人员正在开发有效的抗体筛选程序，这些程序结合了荧光激活的细胞分选技术。

将FACS与细胞间相互作用系统结合

免疫化学教授Scripps Research研究所的Richard A. Lerner博士说：“FACS是用于发现免疫激动剂（一种调节细胞间通路的蛋白）的一项重要技术方法。”现在已经开发了几种FACS方法来产生针对特定蛋白质的抗体。然而，这些方法在筛选那些难结合靶点，如膜蛋白抗体方面取得的成果缺十分有限。

Lerner说：“膜蛋白筛选的最大的限制是膜蛋白是一种疏水蛋白，疏水蛋白可以产生很强的非特异性粘性，这就使得在筛选中难以在信号转导途径中转化为可以读取的真实信号。”

为了绕过膜蛋白筛选的需要，Lerner及其同事开发了一种基于酵母细胞与哺乳动物细胞相互作用的细胞筛选平台，该系统可以选择针对天然跨膜蛋白的抗体。在这个结合了酵母展示技术和FACS的平台上，酵母细胞和带有哺乳动物抗原靶点的细胞被两种不同的荧光标记，而酵母细胞-哺乳动物细胞复合物则可以通过FACS进行鉴定。

使用这种方法，Lerner及其同事能够对酸敏感离子通道ASIC1a蛋白特异的拮抗剂抗体进行筛选，并且可以测试其亲和力。Lerner指出：“新技术的应用将使针对阿片受体的抗体（重要的G蛋白偶联受体）的相关治疗领域受益。”

Lerner实验室的研究人员将用于表达的天然人类文库的酵母细胞与表达人类GPCRμ阿片受体的哺乳动物细胞配对，他们鉴定了与人类μ阿片受体的激动剂抗体，这些抗体可以避免使用阿片类药物后产生的不良影响。

Lerner断言：“细胞分选已经成为一种必不可少的工具，如果将其用于一系列候选抗体的筛选，它可以定向选择激活转导途径的抗体。然后经过PCR鉴定它是什么抗体。”

微流体酵母展示和分子基因组学配对

GigaGen（GigaGen成立于2017年，细胞治疗，专注于T细胞受体(TCR)的发现和开发，其专利TCR技术是用于抗体发现的业界领先的单细胞免疫库技术。）首席执行官兼联合创始人DavidS. Johnson表示：“我们的想法是，可以通过我们设计的微流控制设备运行细胞样品，并深入研究抗体库。 由GigaGen开发的方法将液滴微流控技术与酵母单链可变片段（scFv）展示和分子基因组学相结合。约翰逊解释说：“这项技术的挑战在于，单细胞水平上保持抗体重链和轻链完整性，以维持抗体的功能。”

微流体对于维持免疫球蛋白重链和轻链的配对至关重要。否则，在大量B细胞裂解后，该配对将丢失。表达的抗体被束缚在酵母细胞表面，因此可以将酵母文库与目标靶点混合在一起，目标靶点可以是病毒或癌细胞，抗原与酵母细胞结合。流式细胞仪可以对结合物进行分类，也许这些结合物可以成为我们的候选物。

在访问了针对人类程序性细胞死亡蛋白1的独特scFv结合物的抗体库后，Johnson及其同事使用FACS实现了高于平均数值800倍的富集。通过此步骤可以消除大多数来自免疫小鼠库的抗体，这表明它们不能够有效的结合是免疫原。在表达为全长抗体的候选抗体中，有九种基于细胞检查点阻断试验中作为潜在候选抗体出现。

我们每小时可以运行几百万个细胞，这使我们能够深入研究细胞库。Johnson断言：这种廉价且省时的策略可以替代基于杂交瘤技术的抗体发现。他继续说：“我们的方法非常迅速地提供了很多多样性的样本，这构成了我们发现工作的重要组成部分，我们正在寻找能做许多以前做不了的稀有抗体。”

GigaGen的研究人员正在将这种策略用于其某些传染病计划。约翰逊说：“我们对特定传染病中康复的患者特别感兴趣，因为他们往往具有一些对病原体具有中和作用的抗体。”“而且我们的策略提供了一种廉价的方法来实现这一目标。”

在传染病方面的优势之一是：目标靶点的识别更加快速且容易。但是，对于癌症研究（这是GigaGen的另一项努力），目标物的识别更具挑战性，因为癌细胞在体内不断发生着变化。

细胞突触间传递的复杂性

华盛顿大学儿科学助理教授、整合脑研究中心首席研究员斯蒂芬·史密斯（StephenEP Smith）博士说：“我们的策略被称为流式细胞术（IP-FCM）检测免疫沉淀。” “它通常专注于免疫沉淀蛋白，但也可以很容易地用于抗体的筛选。”

IP-FCM的优点之一是，与同类实验技术相比，它所需的蛋白质数量要少得多。例如，在常规的蛋白质印迹实验中，如果要检测蛋白质，即要表现为可观察的到条带，则需要蛋白质含量比较高。Smith指出：“ IP-FCM要求只有数百个五微米的微珠被足够的蛋白质包被就可以获得抗体结合。”

Smith实验室中的研究人员使用该技术免疫沉淀蛋白质复合物，随后用荧光偶联的抗体探测蛋白质复合物的不同组成。Smith说：“我们能够使用蛋白质相互作用，并观察蛋白质相互作用的整体变化，我们认为这与细胞信号传导的问题有关。”

荧光激活细胞分选技术最近已用于筛选针对Zika病毒的酵母菌展示的人纤连蛋白结构域（Fn3）库。此处展示了该工作的流程中概述的，此方法实现了病毒粒子结合Fn3的从头分离。该方法可以扩展为开发与其他具有挑战性的靶标抗原的结合物，从而允许开发与靶标抗原结合的Fn3，用于一系列生物制药应用。

史密斯实验室的研究人员专注于谷氨酸突触信号传导的研究，了解突触输入下游的蛋白质相互作用如何响应自闭症可能带来的不同类型的突触输入。Smith表示：“与传统方法相比，这是查看信号转导网络的另一种方式。”

已经发现有数百个基因与自闭症有关，但是了解它们如何与失调的单个细胞通路途径的共同联系是一项艰巨的任务。史密斯说：“我们喜欢将这种比喻与癌症联系起来。”数百种突变分别与多种癌症类型相关，尽管每位患者的癌症都是独特的，但所有癌症的突变都进入一个共同的细胞生长途径。他继续说：“类似地，每位自闭症患者都可能代表一种超罕见疾病，但问题是这些不同的突变如何进入突触输入下游的细胞信号通路。”

抗原抗体筛选

威斯康星大学麦迪逊分校实验室副研究员皮特·海因泽尔曼博士说：“当一种抗原难以使用时，一小部分的酵母展示抗体类似物文库可以使人们识别与该靶点结合的分子。”Heinzelman及其同事最近的一项工作集中在鉴定整个寨卡病毒粒子的结合物。考虑到感染的严重性，多种并发症以及缺乏疫苗或有效疗法，寨卡病毒代表了重大的医学和公共卫生挑战。

传统上，产生针对病毒的抗体或其他结合物涉及给动物接种疫苗，这是一项艰巨的任务，在许多实验室中并不总是可以做到的。此外，获得可接受水平的抗体或抗体类似物特异性和有亲和力的抗体通常需要体外工程平台。最后，在表达免疫球蛋白时，实验室面临技术和经济上的限制。

Heinzelman回忆说：“我们想做的是摄取少量病毒，无需动物实验，只需一个酵母展示库即可鉴定与病毒体结合的分子。” 尽管这是先前通过噬菌体展示完成的，但由于需要通过繁琐的纯化程序分离大量病毒，因此用酵母展示的方法要困难一些。

Heinzelman及其同事使用的方法涉及对从酵母表面展示的抗体类似物（即人纤连蛋白结构域）获得的克隆进行FACS，以对抗整个寨卡病毒。Heinzelman说：“我们不需要经过劳动密集型的病毒纯化过程，就很容易从产生的克隆突变体中，找到针对病毒具有更高亲和力的结合物。”

用FACS筛选具有特异性抗原结合突变的文库有助于分离具有增强的寨卡病毒结合的克隆抗体，使用ELISA分析表明它们的亲和力处于较低的摩尔范围内。Heinzelman预计：“我们将使用该策略进行其他目标粘合剂的分选和应用，而这些应用使用其他方法很难解决或不可能解决。”

在未发表的工作中，Smith及其同事进行了同一实验的两个版本，一个版本使用IP-FCM，另一个版本使用质谱。然后，科学家们比较了这些方法捕获蛋白质相互作用的动力学的情况。“虽然两种方法彼此一致，但我们的技术能够看到20–30个相互作用的变化，而质谱仅捕获了5个相互作用，” Smith说。

验证IP-FCM敏感性的研究测量了小鼠脑脊液中亨廷顿蛋白的含量。尽管定量亨廷顿蛋白既可作为疾病进展的标志物，又可作为监测临床试验中基因沉默的方法（例如，在使用反义寡核苷酸期间），但传统的蛋白质定量技术在检测脑脊液中的蛋白质方面并不成功。这将涉及使用脑组织样本，所以这种方法是不可行的。

通过基于微珠的免疫沉淀与IP-FCM相结合，Smith及其同事开发了一种高度灵敏的测定方法，该方法能够准确检测亨廷顿氏病患者和小鼠模型的脑脊液中突变的亨廷顿蛋白，从而提高了将该技术应用于研究和作为临床生物标志物的目的。

Smith说：“我们所依靠的抗体，它们是我们所拥有的最好，最有效的试剂。”我们关注的问题之一是抗体是否具有足够的特异性，这涉及大量的质量控制步骤。Smith指出：“但是每种抗体都是独特的，而且当商业抗体供应商决定停止生产抗体时，这对于研究计划而言可能是毁灭性的。”

抗体发现解决方案

细胞分选仪器商提供了流式细胞仪以外的完整分析解决方案组合，可以帮助实现个性化诊断，药物开发和疾病监测。流式细胞仪和试剂可帮助生物制药的合作伙伴识别新型治疗性抗体。

通过其结合在细胞上的靶点，使用流式细胞仪可以快速筛选和验证这些新抗体的特异性，细胞分选系统可对细胞增殖，形态和活力进行标记且进行实时的监测。

随着分析技术的发展，根据特定患者的情况，筛查新药和疗法的速度会大大加快，也越来越个性化。

本文转载自“生物制品圈”。

文章来源：

https://www.genengnews.com/topics/drug-discovery/antibody-screening-technology-is-never-out-of-sorts/