单域抗体（single-domain antibody, sdAb）是一种由骆驼或软骨鱼表达的仅具有重链可变区的抗体。单域抗体具有易表达、水溶性好、稳定性强、免疫原性弱等特点，动物实验表明，单域抗体更容易穿透组织，且体内半衰期更短，使其能被理想地应用于各种生物技术和肿瘤临床治疗。单域抗体可以与多种化学物质偶联形成复合型分子偶联的sdAb, 其中包括放射性同位素、荧光染料、生物素、磁珠、亲和基质等，因此可用于多种模式的在体肿瘤成像，在基础研究、探针开发等领域有着广阔的应用前景。

分子影像由于可以用于显示细胞和亚细胞水平的特定靶向分子的成像技术，因此在医学领域极具有应用价值。较CT、经典MRI、X射线等经典影像技术例如而言，分子影像具有较高的灵敏度和特异性，因此临床应用范围广，潜在的研究价值高。目前，分子影像学包括光学成像、PET/SPECT成像、超声造影技术等。可以与靶向分子结合并能产生影像学信号的分子探针影响分子成像的发展，目前常见的分子探针包括与放射性核素、生物素、顺磁性粒子、荧光素等物质化学偶联的多肽、单克隆抗体、寡聚核苷酸等。寻找和研发灵敏度更高、特异性更强、信噪比更高的分子探针是科研人员持续关注的话题。本文总结了一类可以作为分子探针开发方向的抗体——单域抗体（single-domain antibody, sdAb）的基本情况及它在分子成像中的应用，以期为该领域的研究提供帮助。

1 单域抗体的基本情况

1.1 单域抗体的分子结构

1993年，Hamers-Casterman教授的实验室在分析单峰骆驼血清中的免疫球蛋白G分子（IgG）时，发现了两种不同于IgG1结构的抗体组份：IgG2和IgG3（MW~90 kDa），这两类抗体为缺乏轻链、仅含有重链的抗体（heavy-chain antibod-ies，HCAbs），为重链的同型二聚体(homo-dimeric heavy-chain)，其占所有血清IgG的75%。1995年， Greenberg等研究发现了护士鲨（nurse shark）体内存在大量HCAbs，证实了HCAbs的存在。感染了伊氏锥虫的骆驼的抗体通过放射免疫沉淀和印迹实验显示出IgG2和IgG3的重链部分具有强结合活性。

目前普遍认为HCAbs和传统抗体相比具有如下分子及结构特征。首先，重链的同型二聚体缺少轻链及第一个恒定区，重链可变区抗体Fc段结合通过铰链区链接。一般认为CH1区外显子和内含子边界存在的非剪接位点上的点突变导致HCAbs缺乏CH1区。此外，重链可变区的FR2中有4个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸所取代，即Val42→Phe/Tyr，Gly49→Glu，Leu50→Arg/Cys和Trp52→Gly/Phe，这导致了HCAbs的重链无法与轻链配，也阻止了单域重链抗体 (variable domain of theheavy-chain antibody, VHH)的聚合。此外，VHH有更长的CDR3，VHH的CDR3大致由16~24个氨基酸组成，甚至有些单域抗体的CDR3超过25个氨基酸，相对于传统单抗，其CDR3仅有7~12个氨基酸。这种长CDR3结构形成的凸环有利于单链抗体与抗原分子的隐蔽的抗原表位，这也是提高单链抗体对抗原结合能力的主要原因。同时VHH的CDR3中的Cys和CDR1中的Cys残基可形成额外的环间二硫键，以稳定较长的CDR3。

1.2 单域抗体的生物学特性

骆驼VHH基因与人类Ⅲ族VH3结构域的编码基因高度同源。因此，骆驼来源的单域抗体在人体中具有更低的免疫原性。此外，单域抗体高热稳定性和重折叠能力较好，在暴露于极端条件下，也表现出高溶解度和重折叠能力。这种能力可能与疏水性氨基酸的突变有关。例如来自美洲驼的咖啡因特异性重链抗体片段（VHH），能够在70℃结合咖啡因，在暴露于高达90℃的温度后仍能恢复其反应性。

单域抗体与常规抗体相比，具有更高的组织穿透率，且血液清除率也更迅速，由于可以快速地到达肿瘤部位，使其能被理想地应用于各种生物技术和治疗。sdAb可以被串联克隆成具有不同特异性的sdAb，例如血清白蛋白，可协助sdAb靶向特定区室，增加试剂的体内半衰期，继而降低给药计量和频率。单价sdAbs可以与放射性同位素、荧光染料、生物素、磁珠、亲和基质等化学缀合。放射性标记的sdAbs可用于体内肿瘤成像。

2 单域抗体在分子影像中的应用

2.1 单域抗体在PET/SPECT中的应用

放射性标记的单克隆抗体（mAb）可用于靶向分子成像探针的制备。但其主要缺点是在血液中的停留时间从几天到几周不等，由于较低的组织穿透率，通常在注射后2-4天，靶组织与周围组织之间才有明显的放射性信号的峰值对比。因此长半衰期的放射性核素如89Zr（t1/2=78.4 h）或124I（t1/2=100.3 h）被用于单克隆抗体放射性标记。89Zr标记的西妥昔单抗用于在晚期结直肠癌患者中的PET显像过程中，注射后的第六天为显像的最佳时间点。相比之下， VHH片段拥有更快的血液清除率，可以用短半衰期的放射性核素如68Ga（t1/2=68 min），18F （t1/2=110 min）或64Cu（t1/2=12.7 h）等进行标记。

例如， 68Ga标记的anti-HER2的单域抗体在乳腺癌患者体内的PET/CT显像过程中，注射后60~90分钟显像效果达到最佳状态。其生物分布特征有利于通过分子影像技术检测肿瘤：其在肾、肝和肠中摄取最高，但在检测原发性乳腺癌或肿瘤转移时，其他器官的背景水平非常低。

而标记99mTc的anti-EGFR单域抗体，通过SPECT分析，能够在体内检测出中高度EGFR过表达的肿瘤。同时，生物分布实验进一步证实了单域抗体对体内肿瘤成像的适用性。在肿瘤部位，定量聚集的核素标记的抗EGFR单域抗体有望监测表达EGFR的肿瘤治疗情况。

除了HER2和EGFR位点外， 99mTc标记了靶向anti-CEA单域抗体NbCEA5在抗体注射后1小时，可观察到较强的肿瘤摄取。

总而言之，快速的探针清除，高效的肿瘤靶向与低背景信号等特点相结合，促成了单域抗体在PET/SPECT中的应用。

2.2 单域抗体在光学影像中的应用

单域抗体也可以与合适的荧光团结合，用来进行肿瘤的光学成像。近红外（Near Infrared， NIR）荧光团的发展使得这种成像方式具有高度的灵活性、灵敏度、速度和成本效益。可以与近红外荧光团IRDye800CW偶联的抗碳酸酐酶9特异性单域抗体，可在手术前和手术过程中应用于缺氧前侵袭性乳腺癌的光学分子成像。而抗碳酸酐酶9常规抗体在注射后的24小时内，因抗体的缓慢清除率导致了不理想的荧光信号对比，只有在给药72小时才获得最佳的肿瘤-正常组织信号比；而在单域抗体探针给药后2小时就已经达到了肿瘤-正常组织的高对比度。使用单域抗体的主要优点是可以获得更快的清除率和更快的图像采集以及更高的对比度，这种药代动力学使得探针注射和外科手术可以在同一天进行。

Anti-EGFR单域抗体7D12和西妥昔单抗分别与近红外荧光团IRDye800CW偶联。注射后30分钟，7D12-IR就可肿瘤显影，而在注射西妥昔单抗-IR的动物体内，在肿瘤部位没有观察到高于背景的信号。同时肿瘤中IR缀合蛋白的定量分析显示，在注射7D12-IR后2小时的肿瘤摄取，显著高于注射西妥昔单抗-IR后24小时肿瘤的摄取。这些结果表明，与NIR荧光团结合的单域抗体具有优异的性能，在临床前快速光学成像和患者补充诊断中很有应用前景。

虽然单域抗体存在诸多优点，但同样也存在着一些劣势。其小分子特征有时对于改造和临床应用是不利的。例如，单域抗体与荧光团等成像标记物联合时，可能改变其抗体的亲和特性。此外，在某些情况下，放射性标记单域抗体在肾脏和肝脏中的摄取量较高，可能会对肝肾功能造成一定的负面影响，并还限制了肝脏和肾脏附近的待测分子的检测灵敏度。并且单域抗体的快速清除有时会限制其与疾病部位的所有表位的最佳结合，导致疾病部位摄取量减少，因此对其进行结构性的改造是必须的。

分子影像作为肿瘤诊断的重要技术，以及肿瘤治疗领域具有广阔前景的学科，在肿瘤学研究中发挥着举足轻重的作用。研究人员当前正致力于开发更新型的有临床优势的探针。单域抗体以其稳定性强、免疫原性弱等诸多优势得到研究者的关注，随着单域抗体制备技术的优化和新生产工艺的出现，以单域抗体为核心的新型分子探针有望为肿瘤的诊疗提供全新的方法。