Hello大家好，还记得上次小爱在《CAR-T细胞如火如荼，CAR-巨噬细胞表示不服》中说到的文献“Chimeric antigen receptors that trigger phagocytosis”不，今天就由实验喵本喵带着大家一起来看一下这篇文献吧~~

总括

嵌合抗原受体（CARs）是合成受体，可以重新编程T细胞使得T细胞能够杀死肿瘤细胞。CAR-T细胞免疫疗法的成功使得基因工程免疫细胞的前景更为明朗，也意味着CAR-T策略可以应用于其他免疫细胞。作者研究设计了一个吞噬作用嵌合抗原受体家族（CAR-Ps），它可以指导巨噬细胞吞噬特定目标，包括癌细胞。CAR-Ps由细胞外抗体片段组成，胞外段被修饰后，可以指导CAR-P靶向特定抗原。通过筛选一组吞噬受体胞内结构域，发现Megf10和FcRγ的胞内域更好的引发了巨噬细胞的吞噬作用。

研究显示CAR-P促进了巨噬细胞对抗原包被合成颗粒和人类癌细胞的特异性吞噬，募集的PI3K可以增加这一吞噬作用。研究显示，将癌细胞和表达CAR-P的小鼠巨噬细胞共培养后，癌细胞减少了40%以上。

接下来我们来看看具体是怎么回事。

作者研究了新的嵌合受体用以靶向吞噬，将其命名为CAR-P（嵌合抗原受体）。CAR-P包含可识别B细胞抗原CD19（αCD19）的胞外单链抗体可变区片段scFv和CD8跨膜结构区域。作者筛选了几个已知的小鼠吞噬细胞受体库：Megf10（图1a），FcRγ、Bai1和MerTK，以CAR-P^GFP（含有胞外αCD19抗体片段及胞质GFP，不含有信号域）为对照。其中FcR引发了吞噬，其他受体则是识别凋亡细胞等碎片。作者用慢病毒将CAR-P转入J774A.1小鼠巨噬细胞，用带有脂双层的二氧化硅beads作为吞噬目标，beads直径5μm。带有His₈标记的CD19胞外结构和嵌入脂双层的NiNTA-lipid结合。与不具有CAR的巨噬细胞相比，表达CAR-P^Megf10或CAR-P^FcRγ的巨噬细胞对CD19 beads的吞噬更为显著（图1b c，图1—视频1）。

图1

而表达CAR-P^Bai1、CAR-P^MerTK和仅表达CAR-P^GFP的巨噬细胞则不会吞噬CD19 beads（图1b、c、图1 —补充图1）。

图1—补充图1

为了证实CAR-P编程初级巨噬细胞是可行的，研究者在原代BMDM（小鼠骨髓巨噬细胞）中表达了CAR-P^FcRγ，发现这些巨噬细胞也能够吞噬CD19 beads。为了验证CAR-P可以靶向其他抗原，作者把αCD19 CAR-P^Megf10换成了αCD22 CAR-P^Megf10。与前面的实验结果一致，αCD22 CAR-P^Megf10可以促进巨噬细胞对CD22 beads的吞噬（图2a）。

之后，作者将αCD19 CAR-P^Megf10巨噬细胞和CD22 beads共培养，αCD22 CAR-P^Megf10巨噬细胞和CD19 beads共培养。结果αCD19 CAR-P^Megf10巨噬细胞并没有吞噬CD22 beads，αCD22 CAR-P^Megf10巨噬细胞也没有吞噬CD19 beads（图2a）。这一结果表明CAR-P^Megf10能够引发巨噬细胞吞噬特异目标且能够靶向多种癌症抗原。

为了进一步验证CAR-P的促进能力，研究者对CAR-P巨噬细胞可吞噬beads的大小进行了研究，研究发现，CAR-P^Megf10能够促使巨噬细胞吞噬2.5-20μm大小的beads（图2b）。 作者进一步测试了改造后巨噬细胞对带有磷脂酰丝氨酸（内源性Megf10配体）的10μm beads的吞噬作用，发现CAR-P^Megf10巨噬细胞对CD19 beads和对含有10%磷脂酰丝氨酸及ICAM（粘附分子）beads的吞噬效率相似。

图2

为了确定CAR-P^Megf10是否是在细胞间连接处启动信号传递，作者将磷酸酪氨酸进行染色。结果显示，在细胞连接处CAR-P^Megf10巨噬细胞的磷酸酪氨酸增加（图3a）。而表达CAR-P^GFP的巨噬细胞则没有这种增加。与此相一致的是，细胞bead连接处的F-肌动蛋白也有富集的现象（图3—补充图1）。这一结果表明，CAR-P^Megf10通过与受体型酪氨酸磷酸酶相关的局部信号级联反应引发吞噬。 

图3—补充图1

成功引发巨噬细胞吞噬的胞内结构域（FcRγ和Megf10）都具有ITAMs（胞质免疫受体酪氨酸基激活Motifs），这些Motifs被Src家族激酶磷酸化。基于这一现象，我们假设当含有ITAM的受体在巨噬细胞中表达时能够引起吞噬作用。T细胞受体的CD3ζ亚单位包含有三个ITAM基序，为了验证CD3ζ链能否激活吞噬信号，作者用第一代CAR转导巨噬细胞（图3b）。CAR能够像CAR-P^Megf10一样引发巨噬细胞吞噬CD19 beads（图3c）。T细胞内，磷酸化的CD3ζITAMs与激酶ZAP70中的串联SH2结构域（tSH2）结合。ZAP70在巨噬细胞中不表达，但是Syk（一种吞噬信号效应物，tSH2结构域含有蛋白质）却高水平表达。

先前研究表明，Syk激酶也可以结合CD3ζ的ITAMs，这说明CAR-T可能通过与CAR-P^FcRγ相似的机制促进吞噬作用。为了定量比较Syk-SH2和CD3ζ或FcRγ在膜近端系统中的相互作用，作者进行了脂质体相关分析（图3d）。

先前在这个系统中，His₁₀-CD3ζ和His₁₀-Lck（CD3ζ磷酸化激酶）通过NiNTA-lipids结合到脂质体上。作者使用荧光淬灭法来测量SH2串联结构域（已标记）和磷酸化CD3ζ的结合。结果显示，Syk-tSH2以相似的亲和力结合CD3ζ和FcRV (分别约为15 nM和30 nM，图3d )。总的来说，这些结果表明CAR-P中的TCR CD3ζ链可以促进吞噬作用，这可能是通过Syk激酶来实现的。

图3

接下来作者将目标放在了对靶细胞的吞噬上，将CAR-P^Megf10、CAR-P^FcRγ巨噬细胞与高表达内源性CD19的癌性Raji B细胞一起培养。引人注目的是，大多数表达CAR-P的巨噬细胞将靶细胞的咬痕内化了（图4a，图4—视频1，78%的CAR-P^Megf10和85%的CAR-P^FcRγ巨噬细胞内化了咬痕）。

图4

这种咬痕表型类似于胞啃作用，也就是以前报道过的啃咬免疫活细胞。这一过程依赖于带有ITAM的细胞内信号结构域，移除信号域CAR-P^GFP能够显著减少胞啃作用（图4a）。细胞间连接处磷酸酪氨酸的富集促进了胞啃作用的激活（图4—补充图1）。

图4—补充图1

此外，CAR-P还能够引起非吞噬细胞的胞啃作用，例如NIH3T3人成纤维细胞（图4—补充图2）。这表明CAR-P可以促进吞噬/非吞噬细胞对癌症依赖性抗原的胞啃作用。

图4—补充图2 

接下来作者将目光放在了人类癌细胞上，观察到表达CAR-P^Megf10或者CAR-P^FcRγ的巨噬细胞可以吞噬 Raji B全细胞（4-8小时内，每100个巨噬细胞会吞噬2个癌细胞，图4b e, 图4—视频2）。吞噬全细胞并不常见，但是啃咬细胞却是时常发生。这表明巨噬细胞与靶细胞间的相互作用是不足以引起对全细胞的吞噬的。

为了进一步确定CD19的调理素作用能够增强对全细胞的吞噬作用，选用了IgG2a anti-CD19抗体对RaJi B细胞进行调理。虽然加入这种抗体并不能引起全细胞内化，但是使用小鼠IgG1 anti-human B6H12抑制“别吃我”信号CD47后，对调理后Raji B全细胞的吞噬作用增加了2.5倍（图4—补充图3）。内源性FcR识别CD47抗体和抑制CD47信号通路可能会促进这一作用。

图4—补充图3

作者假设串联阵列中的信号Motifs组合可能会增加全细胞被吞噬的频率，具体来说就是募集吞噬大目标所需的效应器，以此研发一种可以增强吞噬全细胞的受体。先前的研究表明，PI3K信号对于大目标的内化很重要。作者将能够募集PI3K-p85亚基的CD19胞质结构域（500至534氨基酸）与CAR-P^FcRγ融合，从而产生“串联”CAR（CAR-P^tandem，图4c）。

与CAR-P^FcRγ（图4e）相比，仅含有p85的CAR-P（CAR-P^PI3K）能够诱导一些全细胞吞噬。与CAR-P^GFP相比，CAR-P^tandem的表达使巨噬细胞摄取全细胞的能力增加三倍（每100个巨噬细胞中有6个癌细胞被吃掉，图4d e，图4—视频3 ）。这些数据表明，用于募集不同吞噬效应细胞的Motifs可以增加CAR-P的作用。

为了确定全细胞吞食和胞啃作用的结合是否能够导致癌细胞的显著减少，我们将CAR-P巨噬细胞和Raji B细胞共培养了两天。共培养44小时后，CAR-P巨噬细胞使得Raji B细胞显著减少（图4f）。尽管与CAR-P^FcRγ相比，CAR-P^tandem在全细胞进食方面效率更高，但是两者在消除Raji B细胞方面的表现几乎一样。

重要的是，我们并没有区分全细胞的吞噬和死细胞的胞啃作用，所以CAR-P的存在可能导致了Raji细胞死亡率的增加。总的来说，这些数据表明用CAR-P指导巨噬细胞靶向癌靶点是一个可行策略，可以引起全细胞的吞食和胞啃作用，进而消除癌细胞。

总的来说，我们的研究表明，CAR方法可以应用到T细胞活化以外的生物进程中，并且工程受体在吞噬细胞中的表达足以促进癌细胞的特异性吞噬和消除。

大家看了CAR-巨噬细胞后是不是也会回忆并感叹下CAR-T细胞的强大呢，不知道大家都是怎么进行CAR-T细胞体外验证的呢~现在常用的检测指标为LDH，但是好多小伙伴却发现用LDH检测非特异性背景会非常高（头大），那是因为用LDH检测的时候存在一个问题，那就是除了肿瘤细胞裂解时会释放LDH，被激活后的天然T细胞在凋亡时也会释放LDH呀。这样就会导致整个反应体系LDH的增高，产生虚高数值，让实验者误以为效应细胞存在较强的非特异杀伤。

不过嘛，万事总会有个解决的办法，小爱和LDH说再见，选择了荧光素酶，这下子检测就准确多啦。因为前期小爱将荧光素酶转入靶细胞，之后我们检测到的就是反应体系中细胞裂解后余下的荧光素酶（只有靶细胞会产生荧光素酶）爱康得提供CAR-T药效学评价服务，采用荧光素酶进行CAR-T体内外验证，结果准确，避免高背景值的产生。

服务网址：http://www.icartab.com.cn/article/5/68.html  

话不多说，上图。

使用荧光素酶进行CAR-T细胞体内验证

以荧光素酶和LDH为指标检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果，左图为荧光素酶检测，右图为LDH检测，LDH值会随着效应T细胞的增加而增加。

使用荧光素酶进行CAR-T细胞体外验证

简而言之，我们设计了通过特异抗体介导的相互作用来识别并吞噬目标的吞噬细胞。这一策略可以应用到多个胞外配体（CD19和CD22），可以选用多个胞内信号区域（Megf10, FcRγ, 及CD3ζ）。先前研究表明，Src家族激酶和抑制性磷酸酶之间的空间分离，足以触发T细胞受体的信号传递。我们开发的CAR-Ps同样可以通过在膜-膜界面分配激酶和磷酸酶，将受体-配体结合转化为ITAM结构域的磷酸化受体。

对CAR-Ps的进一步研究可以应用到其他领域。通过直接吞噬癌细胞或者是直接刺激抗原呈递及T细胞介导的反应，我们认为巨噬细胞可以导致目标肿瘤细胞的死亡。研究显示抑制“别吃我”信号通路“CD47-SIRPA”也可以使得癌细胞被吞噬。最近的一项研究表明，当CD47抑制与促进靶吞噬的阳性信号结合时最有效，这增加了将CAR-P表达与CD47或SIRPA抑制结合的可能性。

虽然我们可以通过募集PI3K的活化亚基来增加对全细胞的吞噬，但是比起全细胞吞噬20μm颗粒会更频繁。假设这是由被吞噬目标的物理性质引起的。具体来说，增加目标硬度有助于吞噬，这表明改变吞噬目标的物理性质是提升CAR-P效率的潜在方法。

虽然CAR-P可以促使吞噬完整的活癌细胞，但是更多的是消化掉目标的一部分。胞啃作用，或者是啃食活细胞，在免疫细胞和食脑阿米巴原虫中也有相应的报道。体内研究也显示内源性树突状细胞对活性癌细胞的吞食消化可以引起肿瘤新抗原的表达。

虽然我们能够使用CAR-P在树突细胞中诱导胞啃作用，但是我们不能检测到卵蛋白模型抗原的稳定交叉表达（图4—补充图4）。尽管使用CAR - Ps来增强癌症抗原的交叉表达是一个有趣的未来途径，但是这种策略可能需要对所使用的树突细胞或CAR-P受体本身进行更多优化。

图4—补充图4

总的来说，我们的研究表明，CAR方法可以应用到T细胞活化以外的生物进程中，并且工程受体在吞噬细胞中的表达足以促进癌细胞的特异性吞噬和消除。

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